卡介苗（BCG）DNA 國(guó)家參考品
National reference for BCG DNA
【批號(hào)】230024-200901
【性狀】?jī)龈煞?br /> 【用途】本參考品從我國(guó)卡介苗生產(chǎn)用工作種子批上海株 D2-甲 12
（2）培養(yǎng)的菌體中提取，經(jīng)多重聚合酶鏈反應(yīng)（mPCR）檢測(cè)卡介菌
特異性缺失區(qū) RD1，鑒定為卡介菌 DNA，并經(jīng)國(guó)內(nèi)有關(guān)單位復(fù)核驗(yàn)證。
供卡介菌菌株、卡介菌核酸類(lèi)制品鑒別實(shí)驗(yàn)用定性參考品。
【包裝】安瓿瓶
【規(guī)格】3 μg/支
【使用方法和要求】
1、使用方法
取本參考品 1 支，加入滅菌超純水 200 μL 復(fù)溶，靜置 2-3 min
待用。
采用 ET1（5'-AAGCGGTTGCCGCCGACCGACC-3'）、ET2
（5'-CTGGCTATATTCCTGGGCCCGG-3'）、ET3
（5'-GAGGCGATCTGGCGGTTTGGGG-3'）三條引物，分別以滅菌超純水稀
釋至終濃度為 10 μM。取參考品溶液 5 μL，加至 45 μL 反應(yīng)試劑
中【10 倍 PCR 緩沖液（pH8.3 100 mM Tris-HCl，500 mM KCl，15 mM
MgCl2）5 μL、dNTP Mixture 2 μL、5 U/μL Taq 酶 0.3 μL、2 μL引物 ET1、4 μL 引物 ET2、2 μL 引物 ET3，滅菌超純水 29.7 μL】，
共 50 μL 反應(yīng)體系。
反應(yīng)體系于 94℃預(yù)變性 10 min，然后 94℃變性 1 min、64℃退
火 1 min、72℃延伸 30 s，循環(huán) 30 次后，72℃再延伸 7 min。取 PCR
產(chǎn)物 10 μL 加 6 倍上樣緩沖液（配方：1、吸取 2 mL EDTA（500 mM
pH 8.0）加入約 40 mL 雙蒸水；2、再稱(chēng)量 250 mg 溴酚藍(lán)；3、量取
50 mL 丙三醇；4、定容至 100 mL，4 度保存）2 μL 混勻，上樣于
3%的瓊脂糖凝膠泳道，分子量標(biāo)記物（50 bp DNA ladder ）直接上
樣 6 μL。于 100 mA 電泳 50 min。根據(jù)凝膠成像結(jié)果，以 50 bp DNA
ladder 為分子量標(biāo)記，觀察參考品 PCR 擴(kuò)增片段分子量大小。
2、判定標(biāo)準(zhǔn)
參考品擴(kuò)增片段為約 200 bp（測(cè)序?yàn)?193 bp）的核酸片段，供
試品與參考品的擴(kuò)增條帶長(zhǎng)度一致。結(jié)果判斷模式圖如下