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| 微生物培養(yǎng)基的配制與滅菌需要注意的事項 | |||
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發(fā)酵培養(yǎng)基主要是為了供菌種生長、繁殖和合成產(chǎn)物之用。培養(yǎng)基它既要使種子接種后能迅速生長，達到一定的菌絲濃度，又要使長好的菌體能迅速合成需產(chǎn)物。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成除有菌體生長所必需的元素和化合物外，還要有產(chǎn)物所需的特定元素、前體和促進劑等。但若因生長和生物合成產(chǎn)物需要的總的碳源、氮源、磷源等的濃度太高，或生長和合成兩階段各需的最佳條件要求不同時，則可考慮培養(yǎng)基用分批補料來加以滿足。
操作方法和注意事項如下：加水，打開滅菌鍋蓋，向鍋內(nèi)加水到水位線。立式消毒鍋最好用已煮開過的水，以便減少水垢在鍋內(nèi)的積存。注意水要加夠，防止滅菌過程中干鍋。裝料、加蓋，滅菌材料放好后，關閉滅菌器蓋，采用對角式均勻擰緊鍋蓋上的螺旋，使蒸汽鍋密閉，勿使漏氣。排氣，打開排氣口(也叫放氣閥)。用電爐加熱，待水煮沸后，水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出，當有大量蒸汽排出時，維持5min，使鍋內(nèi)冷空氣完全排凈。標準樣品
升壓、保壓和降壓，當鍋內(nèi)冷空氣排凈時，即可關閉排氣閥，壓力開始上升。當壓力上升至所需壓力時，控制電壓以維持恒溫，并開始計算滅菌時間，待時間達到要求（一般培養(yǎng)基和器皿滅菌控制在121℃，20min）后，停止加熱，待壓力降至接近“0”時，打開放氣閥。注意不能過早過急地排氣，否則會由于瓶內(nèi)壓力下降的速度比鍋內(nèi)慢而造成瓶內(nèi)液體沖出容器之外。
滅菌后的培養(yǎng)基空白培養(yǎng)，滅菌后的培養(yǎng)基放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)24h培養(yǎng)無菌生長，可保存?zhèn)溆茫恍泵媾囵B(yǎng)基取出后，立即擺成斜面后空白培養(yǎng)；半固體的培養(yǎng)基垂直放置凝成半固體深層瓊脂后，空白培養(yǎng)。
細菌培養(yǎng)的基礎是配制培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方然后再加熱溶解，補足水分，其制作過程包括以下幾個環(huán)節(jié)：①清潔玻璃器皿 一般用肥皂液煮沸30 min,或用重鉻酸鉀和濃硫酸配制的溶液浸泡數(shù)10 min，然后用清水沖洗，晾干后保存?zhèn)溆谩＂谂渲埔后w培養(yǎng)基 a．根據(jù)需要配制培養(yǎng)基數(shù)量，先在燒杯中注入少量蒸餾水；b．按培養(yǎng)基配方稱量各種成分的原料，依次使之溶解；c．補足需水量；d．如用牛肉膏、蛋白胨配制時，需加熱熔化后溶解；e．加熱后，補足水分即可。③配制固體培養(yǎng)基 在液體培養(yǎng)基里加入一定量的瓊脂，加熱熔化即可。④調(diào)pH 先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基滴加1 mol/L 的NaOH溶液，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測pH,直到7.4～7.6為止。反之則用1 mol/L的HCl進行調(diào)節(jié)。⑤過濾分裝 用紗布趁熱過濾，將濾液分裝于試管中，其量約為試管體積的1/5（不要玷污管壁）。⑥加棉塞 培養(yǎng)基分裝完畢以后，在管口上加一個棉塞。棉塞能防止雜菌污染；保證通氣良好，加棉塞時，應使棉塞長度的2/3在試管口內(nèi)。⑦包扎 每10支試管用線繩捆成一捆，并且在管口外面包上一層牛皮紙，然后用線繩扎好。在每捆試管外掛上標簽，注明培養(yǎng)基名稱、配制日期和制作者姓名。
（2）滅菌 高壓蒸汽滅菌的效果是細菌培養(yǎng)的關鍵。具體操作如下：①打開高壓滅菌鍋，取出里面的滅菌桶，向鍋內(nèi)加水（最好用開水）水面與底架平齊為宜。②將扎好的試管管口向上，豎放在滅菌桶內(nèi)，再將滅菌桶放回滅菌鍋。注意：滅菌桶內(nèi)的物品不能放得太擠，否則會影響滅菌效果。③加蓋，并將排氣軟管插入滅菌桶的排氣槽內(nèi)。以兩兩對稱的方式，同時旋緊相對的兩個緊固螺栓，以防漏氣。④排出鍋內(nèi)的冷空氣。⑤當鍋內(nèi)的壓力上升到規(guī)定壓力時，維持壓力20 min，切斷電源。⑥壓力降至0以后，打開排氣閥，排氣完畢打開滅菌鍋。
（3）擱置斜面 如果要制作斜面培養(yǎng)基，將滅菌后的培養(yǎng)基冷卻到50℃，每個試管帶棉塞的一端擱在一根木棒上，使培養(yǎng)基形成斜面，斜面的長度不超過試管總長度的一半。
(4) 檢驗滅菌效果滅菌好的培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，檢驗滅菌效果。
培養(yǎng)基配制注意事項：注意營養(yǎng)物質(zhì)的濃度比和C/N比。如:糖分含量要適合微生物生長才能良好,糖分過多則抑制微生物生長。一般微生物適宜C/N是25:1( 元素C/N的比值,也指培養(yǎng)基中還原糖的含量與粗蛋白質(zhì)含量的比值)。 |
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