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		微生物實驗用菌種如何保存的方法（一）

　　微生物實驗用菌種是進(jìn)行新產(chǎn)品研發(fā)和生產(chǎn)質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。為了保證微生物實驗的準(zhǔn)確靈敏和人員及環(huán)境的衛(wèi)生安全，特制定以下規(guī)定：

　　1. 菌種采集。實驗室用菌種一是到國家法定機構(gòu)采購，二是購買ATCC菌種，三是科研中菌種交流。不管是哪種來源，均由公司統(tǒng)一采集。采集中嚴(yán)格按照規(guī)范執(zhí)行。要求包裝可靠，采集迅速，不泄漏不污染。保證菌種合格和環(huán)境安全。采集中要有菌種傳代標(biāo)識。

　　2.菌種的活化：購買的標(biāo)準(zhǔn)菌種必須要求是凍干粉，科研中菌種交流可以為斜面或液體。

　　菌種的首次活化最好是在非選擇性瓊脂培養(yǎng)基上，除非特殊情況或特別推薦，一般不用液體培養(yǎng)基。具體使用培養(yǎng)基的情況如下表，詳細(xì)菌種使用方法見附表：

　　方法：①胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)，非選擇性羊血瓊脂，PCA或營養(yǎng)瓊脂，35℃正常環(huán)境培養(yǎng)24-48小時。②非選擇性羊血瓊脂，35℃正常環(huán)境培養(yǎng)24-48小時。③巧克力瓊脂平板，35℃5-10%CO2環(huán)境培養(yǎng)24-48小時。④ CDC厭氧血瓊脂35℃厭氧培養(yǎng)48-72小時；部分專性厭氧菌能需要5-7天，才能充分生長；對于梭菌，以下新鮮培養(yǎng)基也可選用：營養(yǎng)瓊脂，TSA瓊脂，PCA瓊脂，需培養(yǎng)48-96小時。⑤沙堡氏葡萄糖Emmons瓊脂25-28℃培養(yǎng)3-7天；也可用PDA瓊脂。⑥巧克力瓊脂平板，35℃微需氧環(huán)境培養(yǎng)48-72小時。⑦ 改良羅氏瓊脂或Middlebrook瓊脂，35℃5-10%CO2或正常環(huán)境培養(yǎng)7天。⑧ 緩沖活性碳酵母提取物瓊脂，35℃正常環(huán)境培養(yǎng)3-5天。⑨巧克力瓊脂平板，35℃5-10%CO2環(huán)境培養(yǎng)48小時。⑩ 先用腦心浸出液肉湯或TSB培養(yǎng)基35℃增菌培養(yǎng)18-24小時，再劃線至TSA瓊脂35℃正常環(huán)境培養(yǎng)24-48小時。11、先接種于MRS肉湯35℃增菌培養(yǎng)24-48小時，再劃線接種至含羊血的哥倫比亞CNA培養(yǎng)基35℃5%CO2環(huán)境培養(yǎng)24-48小時。12、 PDA瓊脂45℃正常環(huán)境培養(yǎng)48-72小時。13、先接種于10B精氨酸肉湯，作系列梯度稀釋35℃正常培養(yǎng)至培養(yǎng)基變成粉紅色，接入A-8瓊脂。

　　3.菌種保存。所有菌種均由實驗室專人(雙人雙鎖)保存于專用冰箱或其它保存方式。要建立菌種登記臺帳，詳細(xì)記錄菌種采集、保管、制備、使用、處置情況；每一種菌種一定要有本公司的檢測鑒定報告（具體的的鑒定方法見ATCC提供的菌種證書方法）；具體菌種保存方法如下：

　　3.1 干粉菌種：購買的干粉菌種保存于2-8℃冰箱中，可保存3-5年。

　　3.2 斜面菌種或液體菌種：

　　3.2.1 液氮罐保存方法：用于第一代菌種的長期保存，每種菌種保存5管。

　?。?）準(zhǔn)備用于液氮保藏的安瓿管或菌種保存管(塑料)，要求能耐受溫度突然變化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1．2mm液體的。

　?。?）加保護(hù)劑與滅菌保存細(xì)菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細(xì)胞時，則將空安瓿管塞上棉塞， 121℃滅菌15分鐘：若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內(nèi)預(yù)先加入保護(hù)劑如10％的甘油蒸餾水溶液或10％二甲亞砜蒸餾水溶液，加入量以能浸沒以后加入的菌落圓塊為限，而后再用121℃滅菌15分鐘。
　　（3）接入菌種：將菌種用10％的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液，裝入已滅菌的安瓿管；霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內(nèi)切取菌落圓塊，放入含有保護(hù)劑的安瓿管內(nèi)，然后用火焰熔封。浸入水中檢查有無漏洞。

　?。?）凍結(jié)再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結(jié)至-30℃。若細(xì)胞急劇冷凍，則在細(xì)胞內(nèi)會形成冰的結(jié)晶，因而降低存活率。

　　（5）保藏經(jīng)凍結(jié)至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器的小圓筒內(nèi)，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內(nèi)。液氮保藏器內(nèi)的氣相為-150℃，液態(tài)氮內(nèi)為-196℃。

　?。?）恢復(fù)培養(yǎng)保藏的菌種需要用時，將安瓿管取出，立即放入38-40℃的水浴中進(jìn)行急劇解凍，直到全部融化為止。再打開安瓿管，將內(nèi)容物移入適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

　　此法除適宜于一般微生物的保藏外，對一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細(xì)菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動物細(xì)胞均可長期保藏，而且性狀不變異。下一頁：微生物實驗用菌種如何保存的方法（二）

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