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		溴化氰活化法是常用的活化方法

　　溴化氰活化法是常用的活化方法之一，活化過程主要是生成亞胺碳酸活性基團(tuán)，它可以和伯氨基（NH2）反應(yīng)，主要生成異脲衍生物。

　　溴化氰活化的基質(zhì)可以在溫和的條件下與配體結(jié)合，結(jié)合的配體量大。利用溴化氰活化的基質(zhì)通過進(jìn)一步處理還可以得到很多其它的衍生物。這種方法的缺點(diǎn)是溴化氰活化法的基質(zhì)和配體偶聯(lián)后生成的異脲衍生物中氨基的pKa＝10.4，所以通常會帶一定的正電荷，從而使基質(zhì)可能有陰離子離子交換作用，增大了非特異性吸附，影響親和層析的分辨率。另外溴化氰活化的基質(zhì)與配體結(jié)合不夠穩(wěn)定，尤其是當(dāng)與小配體結(jié)合時，可能會出現(xiàn)配體脫落現(xiàn)象。另外溴化氰有劇毒、易揮發(fā)，所以操作不便。

　　溴化氰活化瓊脂糖用于配體固相化是實驗室親和層析最常用的技術(shù)之一，該方法簡便廉價，并廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、核酸、凝集素等。下面以此為例介紹親和層析的實驗方法：

　　試劑與配制

　　1.Sepharose 4B

　　2.CNBr（劇毒）

　　3.抗原或抗體

　　4.1Mol/L NaHCO3 取NaHCO3 84.01g加水至1 000ml。

　　5.0.1Mol/L NaHCO3

　　6.2Mol/L NaOH

　　7.0.01Mol/L pH7.4 PBS 0.2Mol/L Na2HPO4 38.0ml ?0.2Mol/L Na2HPO4 162.0ml ??NaCl32.76g 加水至4 000ml。

　　3.8．0.1Mol/L pH 2.8 甘氨酸即氨基乙酸—HCl緩沖液甘氨酸15.01g加水至1 000ml，取此液，加0.2Mol/L HCl84ml加水166ml共500ml。

　　3.9．7Mol/L尿素

　　3.10．0.2Mol/L NaHCO3,（含0.1Mol/L NaCI）1Mol/L NaHCO3 100.00ml NaCl?? 2.93g 加水至500.00ml。

　　瓊脂糖活化

　　1.取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，加少量的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液洗滌，立即轉(zhuǎn)入100ml燒杯中，冰浴置于磁力攪拌器上。

　　2.在通風(fēng)櫥內(nèi)稱取2g溴化氰，加水20ml溶解，然后倒入瓊脂糖中，小心滴加2Mol/L NaOH,使pH保持在11左右，反應(yīng)10min。在1min~2min迅速調(diào)整pH為8.0～11.0維持10min。

　　3.將活化的瓊脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250ml冷的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3抽洗。

　　4.偶聯(lián)蛋白20ml 4B液體相當(dāng)于一半的固相載體。事先將需偶聯(lián)的抗原（或抗體）蛋白200mg置于0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液中透析數(shù)小時(一般偶聯(lián)量為10~30mg/g載體)。

　　5.將活化的瓊脂糖迅速倒入蛋白液中（在1.5min內(nèi)，從抽洗到偶聯(lián)），4℃緩慢攪拌過夜，使蛋白與活化的瓊脂結(jié)合。

　　6.在燒結(jié)玻璃漏斗中用200ml偶聯(lián)緩沖液（0.1mol/L碳酸氫鈉，0.5mol/L氯化鈉，pH8.3）洗偶聯(lián)介質(zhì)一次。

　　7.轉(zhuǎn)移偶聯(lián)介質(zhì)至含100ml阻斷緩沖液（1mol/L乙醇胺，鹽酸調(diào)pH至8.0）的燒瓶內(nèi)，室溫孵育2h或者4℃過夜。

　　8.在燒結(jié)漏斗中依次用100ml偶聯(lián)緩沖液100乙酸鹽緩沖液（0.1mol/L乙酸鈉，0.5mol/L氯化鈉，pH4.0）洗偶聯(lián)介質(zhì)一次，重復(fù)此步驟四次。

　　9.如果不準(zhǔn)備立即使用偶聯(lián)介質(zhì)，影使用含0.02%疊氮鈉的偶聯(lián)緩沖液再洗一次。

　　裝柱

　　1.選柱：不宜過大，一般以1.5×15cm的層析柱可裝偶聯(lián)蛋白的瓊脂糖約30ml。

　　2.裝柱：將已與蛋白偶聯(lián)的瓊脂糖裝入層析柱內(nèi)，擰緊下口夾，讓其下沉，數(shù)分鐘后松開下口夾，使溶液約以1ml/min的速度流出。

　　3.洗柱：以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO3（含0.1Mol/L NaCl）洗滌至洗出液的OD280＜0.02為止。收集全部的洗脫液，測得的OD280值×洗脫液的總ml數(shù)即為未偶聯(lián)蛋白的含量，由此可計算偶聯(lián)率。

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