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		真菌保藏的基本原理及保藏工藝的要點(diǎn)

　　真菌研究及其生物工業(yè)的發(fā)展，必然和安全、長(zhǎng)效的保藏技術(shù)方法聯(lián)系，對(duì)于有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的菌株來(lái)說(shuō)，其保藏技術(shù)處理和保藏過(guò)程中生理、基因性狀的損害、變異，將會(huì)帶來(lái)巨大損失。真菌種類的多樣性異常豐富，據(jù)估計(jì)全世界存在150萬(wàn)種真菌（Hawksworth, 1991），而還不到5%的真菌被描述，只有很少的種類有合適保藏的工藝技術(shù)（Ryan，2000），且保藏效果存在菌株水平上的差異性。本文針對(duì)近幾年真菌保藏領(lǐng)域采取的新技術(shù)、原理及適用的保藏研究對(duì)象進(jìn)行了概述。

　　1、真菌保藏的基本原理及保藏工藝的要點(diǎn)

　　微生物保藏的最終目的是保持菌株的純度、活性、基因信息的完整性、避免菌株變異和降低退化。多種保藏技術(shù)方法適用于真菌的保藏，大體可以分為三類(Smith et al, 2001)：

　　一是讓真菌連續(xù)生長(zhǎng)的保藏技術(shù)。這一類的保藏技術(shù)的特點(diǎn)是不斷的將菌株移植在新鮮的培養(yǎng)基上，并在合適的條件下生長(zhǎng)，隨后至于一個(gè)低溫的環(huán)境中，一般是4-10℃，這類保藏技術(shù)主要包括斜面移植、油管保藏和蒸餾水保藏等方法。

　　二是利用干燥環(huán)境保藏菌株的休眠體，如分生孢子、厚垣孢子等，干燥選用的基質(zhì)可以是空氣、硅膠、土壤、沙子等。

　　三是利用抑制菌株代謝活性的辦法達(dá)到長(zhǎng)期保藏，一般是通過(guò)脫水降低細(xì)胞內(nèi)水分或低溫冷凍，在此過(guò)程中關(guān)鍵環(huán)節(jié)是避免和降低冰晶細(xì)胞造成的傷害，這類保藏工藝包括冷凍干燥法、低溫凍結(jié)和液氮保藏法等。

　　各種保藏方法優(yōu)劣比較如下：

　　表1 各保藏技術(shù)方法的優(yōu)、缺點(diǎn)及保藏周期（引自Ryan & Smith, 2004）

保藏方法	優(yōu)點(diǎn)	缺點(diǎn)	保藏周期
斜面移植法	方法直接,花費(fèi)較少	轉(zhuǎn)接周期短,污染風(fēng)險(xiǎn) 菌株易變異	14d-1年
油管保藏法	方法直接,花費(fèi)較少	菌株退化,污染風(fēng)險(xiǎn) 菌株易變異	-10年
蒸餾水保法	方法直接,花費(fèi)較少	菌株退化,污染風(fēng)險(xiǎn) 菌株易變異	-10年
沙土管保法	方法直接,花費(fèi)較少	濕度大時(shí)易惡化保藏內(nèi)容物太多	-10年
硅膠保藏法	方法直接,花費(fèi)較少	硅膠有毒性影響只能保存產(chǎn)孢子的真菌	-25年
冷凍干燥法	長(zhǎng)時(shí)間保藏容易儲(chǔ)藏及發(fā)放	方法復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，設(shè)備較貴，不適用于不產(chǎn)孢的真菌	-50年
低溫凍結(jié)法（超低溫冰箱保藏）	方法直接降低菌株變異	設(shè)備較貴，必須有電力不間斷供應(yīng)，一些低溫保護(hù)劑可能對(duì)真菌有毒性	-40年
液氮保藏法	適用于大多數(shù)真菌，針對(duì)不同的屬可以最大優(yōu)化處理，降低菌株變異	設(shè)備昂貴，控制降溫速率，必須保證液氮的充足供應(yīng)，降低菌株變異	無(wú)限期

　　注：保藏周期指多數(shù)情況，特例除外。

　　真菌的長(zhǎng)期保藏要保證菌株的生理性狀和遺傳信息的完整性（Ryan & Smith, 2003），而保藏過(guò)程中僅以活性指標(biāo)判斷真菌的是否保藏完好有些片面。Kuhls & Borner (1995) 研究來(lái)自不同菌種保藏中心的同一個(gè)Trichoderma sp菌株時(shí)，再在PCR-指紋檢測(cè)結(jié)果中出現(xiàn)了偏差（Kuhls & Borner , 1995)。Kelly等(1994）將保藏了12年的Fusarium oxysporium f.sp.ciceris 和這一種的其他菌株比較，發(fā)現(xiàn)該菌株沒(méi)有顯現(xiàn)出典型的分子指紋特征，證實(shí)該菌株已發(fā)生退化。Horgen等 (1996) 證實(shí)了Agaricus bisporus 的不同傳代菌株出現(xiàn)染色體異常和RFLP指紋的多型性。一些沒(méi)有經(jīng)過(guò)最優(yōu)化保藏程序的Metarhizium anisopliae 菌株處理，其PCR分子指紋證據(jù)顯示出了多型性的特征，報(bào)道M. anisopliae 菌株經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代培養(yǎng)后，出現(xiàn)“角變”并伴隨著一些生理性狀的變化（Ryan et al., 2002）。Santors 等（2002）報(bào)道Penicillum expansum 長(zhǎng)期保藏后的菌株產(chǎn)棒曲霉素（patulin）和橘霉素（citrinin）的功能受到影響。

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