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		利用PFGE對不同來源的雙歧桿菌進行區(qū)分

　　RoiDWardP等利用PFGE對不同來源的雙歧桿菌進行區(qū)分。RousselY利用PFGE將9株生化特性具有明顯區(qū)別的生產(chǎn)用菌株確定為嗜酸乳芽孢桿菌(LactobacilluacidophiluPFGE雖步驟簡單。需23天，但耗時較長。這就降低了實驗室分析大量樣品的能力，使其應(yīng)用受到限制。

　　脈沖電泳的基本原理所有逾越一定大小的線狀DNA 分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速率相同。當(dāng)線狀DNA 雙鏈體的螺旋半徑逾越凝膠孔徑時。此時凝膠不能再按分子大小篩分DNA DNA 像通過彎管一樣，即達(dá)到分辨率的極限。以其一端指向電場一級而通過凝膠，這種遷移模式稱為“爬行”即使低濃度的瓊脂糖也不能分辨大于750kb線狀DNA 分子。PFGEpulsfieldgelelectrophoresi脈沖電場凝膠電泳，有效地解決了這個問題，此方法為在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當(dāng)電場方向改變后，大DNA 分子便滯留在爬行管里，直至沿新的電場軸向重新定向后，才干繼續(xù)向前移動，DNA 分子越大，這種重排所需要的時間就越長。若DNA 分子變換方向的時間小于電脈沖周期，DNA www.atcc360.com分子就可以按大小分開。由于技術(shù)的改進，現(xiàn)在已可分辨大于5000kbDNA 分子。

　　核糖核酸分型法(rlbo-typ 另一種改良的RFLP采用不同組合的限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA 經(jīng)電泳分離后與標(biāo)記(同位素、生物素或熒光素)核酸探針進行雜交后而顯示不同種群的DNA 指紋圖的差異。核糖核酸分型法(ribotyp一個典型的RFLP衍生方法。至今不過10年的發(fā)展歷史，應(yīng)用脈沖電泳分析法發(fā)展起來的新的實驗技術(shù)。但由于它分離DNA 分子的能力可達(dá)10Mb使得在染色體基因組基礎(chǔ)上的研究開創(chuàng)了新局面。目前已應(yīng)用在真菌尤其是絲狀真菌的分類中，也可用于香菇屬、疫霉屬以及酵母菌的種間

　　原理：細(xì)菌的基因組通常含有多個拷貝的rRNA 基因支配子。因而所產(chǎn)生的限制性片段具有多態(tài)性，每個支配子由16SrRNA 23SrRNA 5SrRNA tRNA 及間隔區(qū)序列組成。不同種群的rRNA 基因支配子中的片段序列存在差異。有可能發(fā)生有用的分類學(xué)信息，而rRNA 基因的激進性又使得利用一個單一的rRNA 探針達(dá)到比較研究的目的成為可能。

　　技術(shù)路線：①內(nèi)切酶消化染色體DNA 及限制性片段的凝膠電泳分離。操作簡單可靠；②同位素標(biāo)志核酸探針；③Southern轉(zhuǎn)印和雜交。目前染色體DNA 提取、純化、酶切均有高品質(zhì)的試劑盒。

　　結(jié)果分析：①不同種群的特異的RFLP帶譜需要特定的限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生；②當(dāng)使用一種限制性內(nèi)切酶消化染色體DNA 時。難以顯示物種間的差異，所產(chǎn)生RFLP帶譜往往相似。但幾種限制性內(nèi)切酶有機結(jié)合發(fā)生的RFLP帶譜甚至可鑒別種內(nèi)株間的差異；⑧如果使用同一規(guī)范分子量為對照，并使用統(tǒng)一的RFLP數(shù)據(jù)庫，那么可將RFLP帶譜作為未知菌株快速鑒定的方法之一；④當(dāng)使用rRNA 作為探針時，通過RFLP可鑒定不同種群的基因組所含的rRNA 基因拷貝數(shù)。

　　低頻限制性內(nèi)切酶片段分析(LFRFA 由于RFLP分析的缺點是DNA 酶切片段較復(fù)雜。則DNA 片段數(shù)量就會大大減少，難于比較。如果選用專一識別68個堿基序列的限制性內(nèi)切酶。這就是低頻限制性內(nèi)切酶片段分析(LFRFA LFRFA 被認(rèn)為是目前分辨率最高的DNA 分型法之一。因其酶切消化所得的片段減少，得到DNA 指紋圖譜較簡單，可用于細(xì)菌的聚類。但是這樣切出的DNA 片段太大而不能用瓊脂糖凝膠電泳分開，只能用脈沖場凝膠電泳(PFGE分開。

　　PFGE被認(rèn)為是分子生物學(xué)分類方法的金標(biāo)準(zhǔn)”www.atcc360.com已經(jīng)進行了很多針對用不同酶消化的細(xì)菌發(fā)生的圖譜的研究。優(yōu)于其他方法。通過計算機凝膠掃描，證明PFGE具有高分辨率且結(jié)果易于分析。軟件分析，可以建立對所有微生物的PFGE圖譜的數(shù)據(jù)庫，以便各菌株間的比較。

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