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| 高效液相色譜儀原理對樣品的進樣方式要求 | |||
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高效液相色譜儀主要的組成部件為高壓輸液泵、進樣裝置、色譜柱、檢測器和色譜數據處理裝置。
1．高壓輸液泵
由于高效液相色譜所使用的色譜柱一般裝填小于10μm的固定相顆粒，故對流動相有較大的阻力，所以對于泵的耐壓有一定的要求。除此之外，對于輸液泵還有泵體材料耐化學腐蝕、輸出流量范圍寬、輸出流量穩定等要求。
高壓輸液泵可以分為恒壓泵和恒流泵兩大類。
恒壓泵是指輸出恒定壓力的泵，當系統阻力不變時可以保持恒定流量，但系統阻力發生變化時，就會影響到系統流量穩定，因此現在基本已不使用。恒流泵是指可輸出恒定體積流量的泵，又分為注射型泵和往復式柱塞泵兩類。注射型泵由于其工作過程中需停流吸液以及價格昂貴等原因，目前基本不用于高效液相色譜儀中。往復式柱塞泵則可以提供低脈動的連續穩定液流，廣泛應用于各種商品化儀器中，并衍生出了雙柱塞往復式并聯泵、雙柱塞往復式串聯泵、雙柱塞獨立驅動的往復式串聯泵等多種設計。
2．進樣裝置
在HPLC分析中由于使用了高效顆粒填料和高壓的流動相，因而對樣品的進樣方式要求提高，需要使樣品在進入色譜柱頭時準確地注人其上端填料的中心，形成集中的一點，以保證擴散效應影響降到最低。為實現以上要求有兩種設計：停流進樣和六通閥進樣，但現在停流進樣技術已經完全被簡單易用的六通閥進樣方式所取代。
3．色譜柱
色譜柱一般使用內壁拋光的直型不銹鋼管作為柱管以獲得高柱效。當使用粗內徑短柱和細內徑色潛柱時，需要注意柱外效應所引起的色譜峰展寬，應該盡量縮短進樣器至檢測器之間的連接管路，以獲得更小的柱外死體積。
HPLC色譜柱裝填的固定相，其基體材料多為全多孔球形或無定形的硅膠顆粒，在高壓下使用勻漿裝柱法裝填，并在色譜柱兩端使用多孔不銹鋼燒結材料的過濾片以阻擋流動相中的微小機械雜質進入，并防止固定相流失。
4．檢測器
檢測器主要用于檢測經色譜柱分離后的組分濃度變化。常用的檢測器為紫外/可見光檢測器、熒光檢測器、示差折光檢測器、蒸發光散射檢測器等。
5．色譜數據處理裝置
高效液相色譜的分析結果數據現已廣泛使用色譜數據工作站來記錄和處理。色譜工作站基于微型計算機的硬件，可以實現如下功能：
(1) 儀器操作參數的控制功能——色譜儀的所有可控參數，均可預先設定并保存記錄，在運行樣品時自動調用并傳輸至儀器。
(2) 數據采集和處理功能——可通過計算機和儀器之間的數據傳輸接口自動采集色譜數據。并根據指定處理參數進行數據處理，提供色譜圖的相關積分數據，還可以選擇不同的標準計算方式來對樣品自動進行計算，得到定性或定量的結果。還具有計算柱效、繪制工作曲線等其他功能。www.atcc360.com
(3) 計量認證功能——通過工作站完成對儀器的自動認證程序，包括流量精度、色譜柱控溫精度、檢測器能量檢測等多項參數，并提供詳細的計量報告。 ．
(4) 多臺儀器的自動控制——可以適時控制多套HPLC、系統，并同時獨立進行方法設定、樣品運行、數據采集處理。
高效液相色譜的原理主要有這幾種：
液—液分配色譜法
(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分界面。當試樣進入色譜柱，溶質在兩相間進行分配。達到平衡時，服從于高效液相色譜計算公式： 高效液相色譜計算公式
式中，cs—溶質在固定相中濃度；cm--溶質在流動相中的濃度； Vs—固定相的體積；Vm—流動相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決于K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動相對K影響不大，LLPC流動相對K影響較大。 a. 正相液 — 液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動相的極性小于固定液的極性。 b. 反相液 — 液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動相的極性大于固定液的極性。 c. 液 — 液分配色譜法的缺點：盡管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解；流動相通過色譜柱時的機械沖擊力，會造成固定液流失。上世紀70年代末發展的化學鍵合固定相（見后），可克服上述缺點。現在應用很廣泛（70~80%）。
液—固色譜法
流動相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據物質吸附作用的不同來進行分離的。其作用機制是：當試樣進入色譜柱時，溶質分子 (X) 和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發生競爭吸附（未進樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：Xm nSa ====== Xa nSm 式中：Xm--流動相中的溶質分子；Sa--固定相中的溶劑分子；Xa--固定相中的溶質分子；Sm--流動相中的溶劑分子。 當吸附競爭反應達平衡時： K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa] 式中：K為吸附平衡常數。[討論：K越大，保留值越大。]
離子交換色譜法
(Ion-exchange Chromatography) IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流 離子交換色譜柱
動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換，依據這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下： X-(溶劑中) (樹脂-R4N Cl-)=== (樹脂-R4N X-) Cl- (溶劑中) 當交換達平衡時： KX=[-R4N X-][ Cl-]/[-R4N Cl-][ X-] 分配系數為： DX=[-R4N X-]/[X-]= KX [-R4N Cl-]/[Cl-] [討論：DX與保留值的關系] 凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。
離子對色譜法
(Ion Pair Chromatography) 離子對色譜法是將一種 ( 或多種 ) 與溶質分子電荷相反的離子 ( 稱為對離子或反離子 ) 加到流動相或固定相中，使其與溶質離子結合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質離子的保留行為。其原 離子色譜儀流程示意
理可用下式表示：X 水相 Y-水相 === X Y-有機相 式中：X 水相--流動相中待分離的有機離子（也可是陽離子）；Y-水相--流動相中帶相反電荷的離子對（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）；X Y---形成的離子對化合物。 當達平衡時： KXY = [X Y-]有機相/[ X ]水相[Y-]水相 根據定義，分配系數為： DX= [X Y-]有機相/[ X ]水相= KXY [Y-]水相 [討論：DX與保留值的關系] 離子對色譜法(特別是反相)發解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、堿和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物堿以及藥物等分離。
離子色譜法
(Ion Chromatography) 用離子交換樹脂為固定相，電解質溶液為流動相。以電導檢測器為通用檢測器，為消除流動相中強電解質背景離子對電導檢測器的干擾，設置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應原理與離子交換色譜法相同。 以陰離子交換樹脂（R-OH）作固定相，分離陰離子（如Br-）為例。當待測陰離子Br-隨流動相（NaOH）進入色譜柱時，發生如下交換反應（洗脫反應為交換反應的逆過程）： 擔體圖示
抑制柱上發生的反應： R-H Na OH- === R-Na H2O R-H Na Br- === R-Na H Br- 可見，通過抑制柱將洗脫液轉變成了電導值很小的水，消除了本底電導的影響；試樣陰離子Br-則被轉化成了相應的酸H Br-，可用電導法靈敏的檢測。 離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用于陽離子分析。
空間排阻色譜法
(Steric Exclusion Chromatography) 空間排阻色譜法以凝膠 (gel) 為固定相。它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數納米到數百納米。溶質在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進行分離，而是按分子大小進行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質的流動力學體積或分子大小有關。試樣進入色譜柱后，隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現，一些很小的分子可以進入所有膠孔并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最后出現。
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